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    天津六环环城线规划图: 英国剑桥医学研究委员会分子生物学实验室的Laura Easton等开发出一种快速、大规模纯化结构上均一的RNA的新方法

    互联网2010年6月3日 1:08 点击:1828

    时时彩网络平台 www.qlgr.net RNA的结构学研究,比如X射线晶体衍射或者核磁共振(NMR),都需要制备毫克级的高纯度RNA。


    RNA的大量合成一般是利用T7 RNA聚合酶对DNA模板进行体外转录,不过随后的纯化非常困难且耗时。利用高速液相层析系统(FPLC)的分子排阻层析能够从RNA产物中有效去除未掺入的NTP、中断的小转录本及模板DNA,但是需要多个准备步骤,如酚/氯仿抽提,以去除T7 RNA聚合酶,以及脱盐和样品浓缩。


     


    英国剑桥医学研究委员会分子生物学实验室的Laura Easton等开发出一种快速、大规模纯化结构上均一的RNA的新方法。这种方法利用的是弱阴离子交换层析,它省略了上述这些繁琐的步骤,更快速地纯化大量RNA。文章发表在《RNA》杂志上。


    整个过程如下:利用T7 RNA聚合酶对线性的质粒DNA进行转录之后,加入EDTA终止反应,并直接上样到DEAE-Sepharose FPLC柱上。最初的流出液含有T7 RNA聚合酶及rNTP。之后一次洗脱出短的中断转录本、期望得到的RNA和质粒DNA。RNA的纯度和均一性由分子排阻层析来验证,而蛋白凝胶电泳证实了纯化的RNA中不含T7 RNA聚合酶。


    利用这种新方法,研究人员能够在4小时内纯化长度在30-500 nt的体外转录RNA,RNA的回收率达90%以上。如果单体RNA和低聚RNA有着足够的电荷差异,那么也能将两者区分开。


    此技术既排除了酚/氯仿抽提,也不需要对RNA变性,不仅简单省时,还能省钱。因为同位素标记的rNTP能够很轻松地从柱流出液中回收利用,这样又能节省一笔费用。


    原文检索:


    Easton et al. 2010. Rapid, nondenaturing RNA purification using weak anion-exchange fast performance liquid chromatography. RNA 16(3):647–653.


    摘要:


    We present a simple and fast method for large-scale purification of RNA oligonucleotides suitable for biochemical and structural studies. RNAs are transcribed in vitro with T7 RNA polymerase using linearized plasmid DNA templates. After addition of EDTA, the crude transcription reaction is subjected directly to weak anion-exchange chromatography using DEAE-sepharose to separate the T7 RNA polymerase, unincorporated rNTPs, small abortive transcripts, and the plasmid DNA template from the desired RNA product. The novel method does neither require tedious phenol/chloroform extraction of the T7 RNA polymerase nor denaturation of the RNA, which is desirable especially for larger RNAs. In addition, isotopically labeled rNTPs can be easily recycled from the column flow-through and oligomeric RNA aggregates can be separated from the natively folded monomeric RNA product.

     

    (来源: 互联网 )


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