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    正规的彩票软件: 抚生试剂- 用噬菌体上清和人血清进行ELISA

    上海抚生实业有限公司2014年5月22日 15:26 点击:421

    时时彩网络平台 www.qlgr.net  用噬菌体上清和人血清进行ELISA

     
    用噬菌体上清和人血清进行ELISA[器材和试剂]
    ● 多孔板 (Immuno plate Maxisorp, Nuric)
    ● 包被缓冲液 (50mmol/L NaHC03, pH 9.6,0.05%硫柳汞)
    ● 单克隆抗体(mAb)57D1。该抗体 能识别M13噬菌体次要衣壳蛋白(pⅢ)的N末端。它是用M13噬菌体 颗粒免疫大鼠而获得的。来自含57D1 杂交瘤细胞的上清用 50% (NH4)2SO4沉淀,然后在PBS中溶 解并透析,最后抗体在蛋白G—Sepha— rose上免疫纯化。
    ● PBST
    ● 封闭液(PBS,5%脱脂牛奶,0.05% Tween—20,0.02%硫柳汞)
    ● 噬菌体上清
    ● 细菌提取物
    ● PEG—浓缩的nRl—11.1噬菌体
    ● 来自无关的大鼠杂交瘤细胞上清
    ● AP标记的羊抗人IgG Fc—特异性抗体 (Sigma),用封闭液按1:5000比例稀释
    ● 底物缓冲液(10%二乙醇胺,0.5mmol/ LMgCl2,0.05%NaN3,用HCl调节到 pH 9.8)
    ● 显色液(1mg/ml p—硝基苯磷酸的底物 缓冲液)
    ● 自动酶标仪
     
    [方法]
    1.将200ul浓度为1ug/ml的抗pⅢmAb 57D1①包被缓冲液,分别加在多孔板各个板孔 中。4℃孵育过夜。
    2.弃去包被液,并用PBST洗涤数次。
    3.每孔加250ul封闭液,37℃孵育60分钟。包被板可立即使用或在一20℃保存数周。
    4.每孔加100ul封闭液和100ul如上述制备的清亮噬菌体上清。在37℃下孵育60分钟以 使噬菌体颗粒结合。
    5.将人血清在200ul封闭液中,室温预孵育30分钟;其中包含2.5ul细菌提取物、大约 5 × 1010pfuPEG—浓缩f1Rl—11.1噬菌体以及10ul来自无关大鼠杂交瘤细胞上清。当 检测单个克隆时,采用1:100比例稀释血清; 当检测噬菌体文库时,采用1:400比 例稀释血清。此步可以减少针对野生型噬菌体的血清抗体、细菌污染物及大鼠抗pⅢ单 抗的干扰。
    6.从包被板中弃去噬茵体上清,并用PBST充分洗涤板孔。
    7.在每孔中加200ul预孵育的血清混合物,在室温下孵育2小时。
    8.除去血清混合物,用PBST充分洗涤板孔。在每孔中加入200ul碱性磷酸酶标记二抗, 室温孵育60分钟。
    9.除去二抗溶液,并用PBST充分洗涤。用底物缓冲液快速洗涤板孔。
    10.在每孔中加200ul显色液,37℃暗处孵育15—60分钟。
    11.用自动酶标仪将A405和A655间的差值作为结果记录。
    (来源: 上海抚生实业有限公司


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