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    江苏快3大小玩法: 2008技术点评:流式细胞分选

    互联网2008年10月23日 10:35 点击:6051

    时时彩网络平台 www.qlgr.net 流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,可以每秒钟分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛,而且还在不断增加。当然,细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征,将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪(fluorescence-activated cell sorter, FACS),其实FACS并不是流式细胞仪的通称,它是BD公司的注册商标。


    细胞分选的原理
    当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴流经过带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,没有充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。


    流式细胞分选的特点
    1. 少量细胞分选时,流式细胞分选精确度高(99%以上),速度快。目前,先进的流式细胞仪的分选速度可达25 000个细胞/秒以上,比传统的分选速度提高了很多倍,原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制,一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个,则需要耗费10小时以上,分选后细胞的活力会受到很大的影响。


    2. 可以同时进行多个Marker分选,正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷,因此在电场中只能向左或向右偏转,即两路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量,从而调整液滴的偏转角度,实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。


    3. 不仅仅限于表面抗原,流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度(如细胞体积)或荧光(如DNA、RNA或蛋白含量,酶活性,特异抗原)散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态,那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。


    4. 如果只是偶尔做几次细胞分选的话,用流式分选还是比较划算的,只需要准备样品和抗体,交纳一定的仪器使用费即可,不需要购买配套的设备。


    流式细胞仪
    由于价格的原因,大家对流式细胞仪一直是心有余而力不足,但现在它也开始进入一些大型实验室了。市场上销售的流式细胞仪产品种类很多,主要生产厂家有:BD、Beckman Coulter、Partec、Accuri Cytometers、Guava、Union Biometrica、Amnis等,大家比较熟悉的还是BD和Beckman Coulter。


    BD公司一直致力于研究生产最先进的流式细胞仪。自从1974年与美国斯坦福大学合作研制出全球第一台流式细胞分析仪以来,BD公司就不断推陈出新,在流式细胞技术领域始终保持领先地位。BD公司的FACSAria流式细胞仪,更是世界上第一台使用石英杯流动池固定光路标准,可以完成高速细胞分选的台式流式细胞仪。它的高速细胞分选和多色分析的性能极佳,而操作却非常简单。


    由于BD FACSAria流式细胞分选仪的出现,高速细胞分选的设置和操作变得极其简单。BD FACSAria先进的仪器设计大大提高了分选性能,同时还增强了其它功能。在普通的空气中液流受激光激发的流式细胞分选仪中,液流高频振动常?;岵藕旁胍?,而BD FACSAria则完全消除了这一弊端。BD FACSAria产生液滴的高频振动发生在石英杯流动池的底部喷嘴处,也就是在样本与激光的正交点之后,这样就不会干扰激光与样本流的聚焦,因而不会产生干扰噪音。去除了这种噪音,检测就更加准确和灵敏了。


    BD FACSAria流式细胞仪的喷嘴与石英杯底部精确吻合,保证液流垂直进入下面的废液吸引器。喷嘴位置是固定的,更换喷嘴后,液流仍然会保持在原来的正确位置上。喷嘴拆换简便、精确。


    BD FACSAria流式细胞仪可以使用70 μm或100 μm的喷嘴,满足了绝大多数细胞分选的需要。喷嘴适合在各种不同的压力和速度下进行细胞分选。两路分选和四路分选是标准设计,分选时可以使用各种大小的细胞收集管(例如小管、12X75 mm管和15 mL管)。配件自动细胞定位分选装置(ACDU)可以将定量细胞定位分选在微孔板或载玻片上。BD FACSAria流式细胞分选仪的性能非常灵活,为流式细胞分选提供了完整的解决方案。


    与传统细胞分选仪器相比,BD FACSAria流式细胞仪的集成设计减小了仪器体积,节省了整个使用空间。实际上,该仪器可以在任何空间里安装工作,不需要其他辅助设备。仪器可以放在普通的实验室平台或桌子上,唯一需要的是一个标准电源插孔。这样就更增加了它的亲和力。


    Beckman Coulter也提供了两种强大的细胞分选系统。他们的CyAn ADP流式细胞仪使用3种激光,可实现9色分析。高速的电子和Summit软件的使用可以有效处理1×108个细胞的样品,来分析那些稀有事件,如肿瘤干细胞研究。另一个MoFlo XDP流式细胞仪分析速度为100 000个细胞/s,分选速度为70 000个细胞/s,并且能在高产量的同时保留细胞的活力和功能。这台仪器也具有四通道分选能力,并且分辨率极高,能够让研究者们更好的鉴定和分选他们感兴趣的细胞群体。

    细胞分选的新进展
    1. 突破分选大小的限制。许多人利用流式细胞仪只要是分选普通培养的哺乳动物细胞,直径一般不超过20微米。但随着流式细胞仪的应用越来越广泛,分选细胞的大小也不应成为限制。美国Union Biometrica公司就提供了市面上唯一的能够分选20-1500 um生物颗粒的流式细胞仪COPAS™系统。COPAS(Complex Object Parametric Analyzer & Sorter)可以分选线虫,果蝇、水螅、蟾蜍、蚊子、斑马鱼的卵和幼虫。COPAS技术的核心,是专利的气流分选装置。这种分选方式非常温和,可以保证收集到的生物活体的活性和完整性,对于后续的培养和分析不会产生任何负面影响,而普通流式细胞仪一般采用电磁场进行分选,会对生物活体产生致命的影响。


    以前这种类型的分选是在显微镜下用镊子操作的,所以COPAS系统的出现对于科学家来说是个好消息。现在发育生物学家就能利用COPAS来分选几千条幼虫,来寻找概率很低的遗传变异。你也可以利用它来筛选药物化合物文库。将药物分布在微量滴定板中,每个孔中再放10条线虫。孵育之后通过ReFLx附件将每个孔的东西逐个吸出,再送回流动室中重新分析。


    2. 在分析的同时成像。普通的流式细胞术无法观测细胞形态、结构,无法定位荧光信号到特定部位,但是现在这也不再是问题了。美国Amnis公司提供的ImageStream 100系统就很好地解决了这一问题。它将流式多色检测技术和荧光显微镜图像显示技术集中在一个平台上,提供了全新的细胞分析方法。ImageStream系统通过明视野、暗视野、荧光的组合,可以得到每个细胞的6张图像。此外,他们还提供ImageStream光学系统的升级——EDF(extended depth of field)配件,可以增加图像的质量,确保整个细胞清晰。EDF使成像速率快了三倍,不仅提高了成像的质量,还具有共聚焦显微镜的优势。这种能提供图像的流式细胞仪在临床上也有重要作用,可以用高通量荧光原位杂交来检测血液中的肿瘤细胞,比现在的方法灵敏多了。


    3. 流式的新帮手。以前,人们只是利用流式细胞仪来看细胞的免疫表型。现在,我们当然不满足于这个,我们还想了解更多复杂的细胞过程,如细胞增殖、活力、凋亡和钙流量。新的荧光染料、新的荧光探针、新的染色方法不断推出,使得新的细胞参数的分析也日益增多。


    应用活细胞进行分析是流式细胞术的一个趋势。研究者们往往利用流式细胞仪收集某种细胞群体,然后将其回输到体内,来观察生理上的变化。Invitrogen就提供一种Vybrant® DyeCycle™染料,能在活细胞中进行细胞周期分析。这种染料毒性极小,分选出的细胞还能用于后续的研究,如干细胞鉴定或细胞治疗。BD公司也提供了观察不同细胞群体的工具。Phosflow细胞信号抗体可以让研究者们在一个复杂的多样群体中研究特异表型的细胞,并在单细胞水平上检测多个蛋白的激活状态。

     

    附录:BD流式试剂选择及常见问题解答
    一、如何搭配流式抗体荧光标记
    流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的:流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪的通道越多,那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多


    A、 如何根据流式细胞仪搭配流式抗体
    1) BD流式细胞仪(06版目录第614页)
    流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的,所以首先需要注意两点:


    流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1、FL2、FL3三个荧光通道/三个颜色,而选配的Calibur (FACSCalibur的简称)配有488nm和635nm两根激光,可以检测FL1-FL4四个通道/4个颜色。


    不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的,比如Calibur的FL3(第3通道)能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能检测PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能检测的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道检测。Calibur和LSR都能检测4个颜色,但是第4个通道检测荧光素是不一样的


    搭配荧光素原则
    搭配流式荧光素有2个原则:每个通道只能选择1种荧光素;各个通道之间的荧光素可以随意搭配,但需注意
    1、每个通道只能选择1种荧光素。以Calibur为例说明,Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择AlexaFluro488,或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素,但是我们我们搭配的时候只能选择其中1个。


    2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配:如果客户的流式细胞仪能做4个通道,在第1个原则之下,那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2跟激光的Calibur为例,Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。
    比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )+P E(F L 2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 这个搭配组合可以更改成Alex Fluro(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+Alex Fluro(FL4),或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PE-Cy5(FL3)+APC(FL4)等等。总之,在第1原则之下,我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是,APC和PE-Cy5一起使用的话,上流式以后,容易导致补偿过度

     

    B、 BD公司抗体有多少种荧光素
    1) 供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的我们需要根据同时结合供应商能提供的每种抗体的荧光素进行搭配。原则上同一个标志的不同的克隆号带同1个荧光素在应用上没有区别的,但是有些不同克隆号的抗体之间可能会有一些稍微的差异,需要仔细看说明书。我们可以尽量选择在说明书上有流式图形的抗体,或者选择荧光素种类最多的克隆号的抗体


    2) 荧光素
    可以登陆www.bdbiosciences.com/spetra,输入荧光素和检测的BD流式细胞仪机型及激发光,就可以查到相应的波长。
    为什么要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢?
    因为这些荧光非常明亮,对激光非常稳定,适合流式细胞仪的光谱性质,对PH值不敏感,具有水溶性。此外,他们联合使用时发射光谱存在巨大差异,无需补偿。

     

    C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?
    如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,那么将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

     

    二、同型对照(Isotypy Control)
    1、为什么要用同型对照?
    同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照,它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前,染色方式如下:
    样本管:一抗+样本
    同型对照管:同型对照+样本


    2、如何选择同型对照?
    一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体,比如抗人的CD56 APC标记的抗体,货号是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,κ,货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体,货号是555901,成分是Mouse IgG1,κ。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ,货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下:
    样本管:纯化的CDw25+PE标记的抗Mouse IgG1+样本
    同型对照管:纯化的同型对照+PE标记的抗Mouse IgG1+样本


    如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,那么优先选择的顺序应该是亚链不同--亚型不同--相同类别。比如,某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b,那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。


    3、如何查找同型对照?
    同型对照在BD英文目录中或者BD网站上跟它对照的抗体的位置是一致的。BD目录中,抗人的抗体的同型对照都在HUMAN章节后面??剐∈蟮目固宓耐投哉赵贛OUSE章节后面,非人类灵长类的抗体同型对照在NON HUMAN PRIMATE章节后面。由于抗大鼠的抗体非常少,大部分抗体都是小鼠来源的,所以它的同型对照跟小鼠的一样,放在MOUSE章节后面。胞内细胞因子、趋化因子、补体、炎症介质及其受体的同型对照放在其章节的后面(注意:人的胞内细胞因子的同型对照跟人的表面标志的同型对照是不在一起的)。Phosflow的同型对照在Phosflow的介绍后面。比如,比如抗人的CD56 APC标记的抗体,货号是555518,在06版BD目录的169页,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型对照应该是在HUMAN章节中Mouse Immunoglobulin Isotype表格中,第191页,APC标记的Mouse IgG1,κ,货号是555751。


    4、哪些客户需要使用同型对照?
    A 对流式不是非常熟悉的客户。
    B 做胞内流式客户,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。
    C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户,因为客户不熟悉不常见标志的表达情况,根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性。
    D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户一般可以不使用同型对照。


    5、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高?
    首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象,在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。

     

    三、补偿微球
    流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好,会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮,而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握,同时,补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时,需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿,才可以得到比较好的数据和图片。那么,现在不需要这么麻烦。因为补偿微球让一切变得更简单。BD CompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本(往往用待测样本单标来进行补偿调节)的缺点。它本身不携带任何荧光,借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等,操作起来很简单,灵敏度高,一致性好,使补偿更轻松更准确,而且最难得的是它最适合于多色分析(如五色、六色、七色等)和复合荧光素(如PE-Cy7、APC-Cy7等),因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存,方便下次做同样的荧光染色搭配时参考用。

    ( 余亮 吴青)


     

    (来源: 互联网 )


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