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    时时彩后一最牛的算法: 生命科学中的FISH技术

    互联网2010年2月6日 13:37 点击:5419

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    荧光原位杂交技术( fluorescence in situ Hybridization,FISH )是一种非放射性原位杂交方法,用特殊的荧光素标记 DNA 探针,在染色体、细胞或组织切片标本上进行 DNA 杂交,以检测细胞内 DNA 或 RNA 特定序列存在与否。近年来随着 FISH 所应用的探针种类的不断增多, FISH 技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用于肿瘤的诊断、基因定位等。原有的放射性同位素原位杂交技术存在许多缺点,如每次检测需要重新进行标记,标记步骤繁琐,标记的探针不稳定,需要较长时间的曝光,并且对环境造成污染,在观察结果时,需要较多的细胞分裂相。此外,由于放射性银粒和染色体聚集在不同平面,可能引起计数上的误差。

    与之比较, FISH 则具有其不可比拟的优点:

    操作简便,一步式反应,能迅速得到结果,一次标记后可使用二年。
    方法敏感,敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。
    在同一标本上,可同时应用几种不同探针,标记不同的颜色。
    可用于分裂细胞和静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。

    荧光原位杂交技术可以传统技术完美结合: FISH 和细胞免疫化学技术结合,可以同时用多种不同颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质,这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点,转录和翻译的产物,有助了解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。 FISH 技术和 RFLE ( RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM )结合,可以精确地描述染色体长,短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。在基因图谱绘制中, FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。


    荧光信号在高压汞灯的短波激发光下,常引起荧光信号发生淬灭,为防止淬灭的发生,需要将 DAPI 或 PI 稀释于 P - Phenlenediomine 的甘油缓冲液中。对于单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察 FITC 、 TEXAS - RED 等多种颜色的 FISH 信号。不论是染色体还是单拷贝基因的 FISH 信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取,也可通过 CCD ( chargecoupled device )的照片系统或 LASER SCANNING IMAGING SYSTERM (激光扫描共焦成像系统)交摄取的信号储存在计算机内,经软件处理后,将信号叠加显示在荧光屏上。

    由于有多种方法标记 DNA 探针,帮一次杂交可以同时观察多个探针的信号,如两个不同的探针分别用 BIOTIN 和 DIGOXIGENIN 标记,杂交后用 AVIDIN - FITC 和抗- DIG - TEXAS - RED 分别与探针上的 BIOTIN 和 TEXAS - RED 信号。采用三种或三种以上不同的半抗原,如 BIOTIN 、 DIG 和 DNP 等标记探针,然后用多种不同颜色的荧光素,如 FITC (绿色), RHODAMINE (红色), CASCADE BLUE (兰色)等结合进行,可同时得到多种不同颜色的荧光信号。

    同上于常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像,彩色胶片不易多曝光,限制了这种联合标记探针的应用,使用 DIGITAL IMAGING CAMERA SYSTEM 或 CCD 照像系统,先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内,而后冠以人为的颜色,运用软件系统融合各次得到的影像,最终形成一个复合的多颜色的图像。

    对已做过 G 显带的染色体片子,用 75 % 的乙醇或甲醇褪色后,可使 FISH 更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常(包括某些复杂的易位,插入,倒位等)。 FISH 和 G 显带技术结合,不仅可以用新近 G 带处理过的片子,而且还可用陈旧的 G 带片子。因些, FISH 技术可成功的帮助细胞遗传学家做回顾性分析。

    绿色荧光 FITC -激发光 495nm ,发射光 520nm

    红色荧光罗丹明( Rhodamine )-激发光 565nm ,发射光 590nm

    为得到最优的观察结果采用特异性单光谱带或三光谱带滤光片

     

    原癌基因 HER2 的变异与乳癌的发生和预后相关。 HER2/neu (也称为 ERBB2 )基因编码 185kD 跨膜细胞表面糖蛋白,是酪氨酸激酶家族的一员,和 EGF-R 存在高度同源性。

    端粒探针

    3q26(hTERC)-5p15(hTERT) 端粒探针 (hTERC;hTERT)

    合成线性染色体端粒末端的端粒酶的活化与 人永生细胞形成和肿瘤细胞形成 有关。在绝大多数的正常细胞和组织中检测不到端粒酶的活性,但在永生细胞和肿瘤细胞中可以检测到。尽管单独端粒酶的活化不会导致肿瘤遗传表现型,体内 TERT 表达促进端粒维持,可能伴随额外的原癌基因突变,产生恶性转化克隆。 48 %的头、颈鳞片状细胞癌( HNSCC )的特点是 3q26-qter 和 5p14-p15 的增加。

    Qbiogene 提供的 3q26 ( hTERC )和 5p15 ( hTERT )采用 ULS 技术生产。但是单独 HTER 和 hTERT 不能导致肿瘤产生或进展。

    这些直接标记探针经培养细胞、血涂片和石蜡包埋切片实验证实。

    5p15 hTERT- 人端粒酶的催化亚基

    端粒酶( hTERT )的反转录酶成分的基因通过荧光原位杂交染色体 5p15.33 确定其图谱。在肿瘤细胞中, hTERT 基因区的拷贝数增加,并且可能是上调端粒酶水平的一条途径。 5p15 扩增在各种肿瘤细胞包括小细胞肺癌,头、颈鳞片状细胞癌、子宫颈癌中得到证明。

     

    FISH有直接法和间接法两种。直接法是用已知碱基序列的特异DNA片段作为探针,并标记上不同荧光素,在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交。因所形成的杂交体带有荧光素。故可在荧光显微镜下直接观察。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texasred)、罗丹明(rhodamine)及其衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRIT)等。该方法简单快捷,但信号较弱.敏感性较低。间接法使用非荧光物质标记的探针。如生物素或地高辛等标记探针,再通过亲和连接或免疫反应带人荧光物质来检测杂交体的存在。因为有杂交信号放大作用,从而增加了杂交的敏感性。也降低了实验成本。故间接法FISH是目前使用较多的方法。

        FISH实验操作与用非荧光标记探针的原位杂交基本相似。在组织准备方面,以新鲜组织、冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞爬片及中期染色体等材料进行FISH的结果优于石蜡包埋组织样本的杂交效果。由于FISH是DNA-DNA原位杂交,故在杂交前的变性处理颇为重要。

        近年来。在FISH技术的基础上发展起来的分子遗传学新技术不断出现,如多色FISH技术、染色质纤维荧光原位杂交(chromatin fiber FISH)和DNA纤维荧光原位杂交(DNA fiber FISH)技术等。多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法),在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜色标记,同时检测多种染色体异常。如许多用染色体涂片方法和G或Q显带技术无法检测或难以确定的染色体异常,通过多色FISH技术可以揭示染色体畸变,并确定畸变的来源。此外,多色FISH对于复杂的染色体核型改变。尤其是实体瘤的染色体检查具有很好的临床应用价值。多色FISH也可采用三种或三种以上不同的标记物。如生物素、地高辛和二硝基苯酚标记探针,然后用不同颜色荧光素,如FITC(绿色)、罗丹明(红色)和cascadeblue(蓝色)标记抗体进行检测(间接法),可同时得到多种不同颜色的荧光信号,这种方法可以在同一标本上同时检测多种DNA序列。

        纤维FISH技术是将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维,然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交,最后用荧光显微镜观察结果并分析,若配合计算机图像分析软件使用,结果会更理想。纤维FISH技术可以快速直接目视判断探针位置以及多个探针间的相对位置、物理位置和重叠程度等,因而大大加速了基因定位和人类基因组高分辨物理图谱的绘制。

        PRINS技术是将PCR和FISH技术联合使用,先由寡核苷酸引物或变性DNA片段与细胞内的靶DNA互补序列复性。在聚合酶的作用下,将荧光标记的脱氧核苷酸(如FITC—1l—dUTP)带人新合成的DNA中。PRINS技术可用于检测罕见的异染色质变异体和评价肿瘤细胞株的染色体异质性。



    (来源: 互联网 )


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