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    太湖新城快速化: 人乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒说明书

    上海宝特生命科学发展有限公司2011年4月25日 9:30 点击:736

    时时彩网络平台 www.qlgr.net 人乙酰胆碱(ACh)ELISA试剂盒说明书
    本试剂盒仅供研究使用                                       

    预期应用
    ELISA法定量测定人血清、血浆、脑脊液或其它相关液体中Ach含量。

    实验原理
    本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中Ach水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入Ach、生物素化的抗人Ach抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Ach呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
    试剂盒组成及试剂配制
    1.         酶联板:一块(96孔)

    2.         标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为1000 nmol/L,做系列倍比稀释后,分别稀释成1000 nmol/L,500 nmol/L ,250 nmol/L,125 nmol/L,62.5 nmol/L,31.2 nmol/L,15.6 nmol/L,其原液直接作为最高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 nmol/L,临用前15分钟内配制。

    如配制500 nmol/L标准品:取0.5ml 1000 nmol/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

    3.         样品稀释液:1×20ml/瓶。

    4.         检测稀释液A:1×10ml/瓶。

    5.         检测稀释液B:1×10ml/瓶。

    6.         检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

    7.         检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。

    8.         底物溶液:1×10ml/瓶。

    9.         浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

    10.     终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

    标本的采集及保存

    1.脑脊液:请离心后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。

    2.血清:标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

    3.血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

    注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
    操作步骤
    各试剂在使用前平衡至室温。

    1.         加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样品100ul,注意不要有气泡,轻轻混匀,酶标板加上盖,37℃反应120分钟。

    2.         弃去液体,甩干,不用洗涤。

    3.         每孔加检测溶液A工作液 100ul,37℃,60分钟。洗板3次,350ul/每孔,甩干。

    4.         每孔加检测溶液B工作液 100ul,37℃,60分钟,洗板5次,甩干。

    5.         依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光显色30分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显)。

    6.         依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

    注:

    1. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

    2.为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

    洗板方法
    手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。
    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
    特异性
        本试剂盒可同时检测重组或天然的人Ach,且与其它相关蛋白无交叉反应。

    计算
      以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

    注意事项
    1.  洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

    2.  一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

    3.  请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。

    4.  如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。

    5.在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

    6.底物请避光保存。

    检测范围:
    15.6 nmol/L -1000 nmo/L

    说明
    1.试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。

    2.有效期:6个月

    3.浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。

    4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。
     

    (来源: 上海宝特生命科学发展有限公司


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