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    体彩江苏7位数中奖规则: IP蛋白纯化如何进行

    上海优宁维生物科技有限公司2013年5月30日 15:09 点击:3109

    时时彩网络平台 www.qlgr.net  IP蛋白纯化如何进行
     
    什么是免疫共沉淀
    免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
     
     

     
    (1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白  免疫共沉淀
    酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;
    (2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;
    (3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;
    (4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;
    (5)免疫沉淀反应后,在4°C 3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;
    (6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
     
    缺点是:
    1 时间时间较长(有两个孵育过夜的步骤)
    2 离心次数较多,操作麻烦
    3 纯度不高,背景高
     
    有没有更好的办法减少操作,简化操作,等到高纯度的蛋白?
     
    详细介绍:
     
    实验时间少,小于2小时:使用独特的MACS技术,免疫沉淀仅需1-2小时,而传统的免疫沉淀需要1天时间 
     
    最小的背景:MACS微珠极少量的非特异性结合以及在柱中有效的洗涤,能够产生高纯度的蛋白方便采用MACS柱进行免疫沉淀,无需离心和重悬步骤温和和通用   使用MACS柱技术,能够得到高产量的靶蛋白,相互作用的伴侣或分子复合体,例如当用于染色质免疫沉淀(ChIP)或核糖体展示时。
     
    分析小规模免疫沉淀的简单方法极小的μMACS TMProteinA微珠和μMACSTMProteinG微珠确保非??焖俚姆从?,所以标记的免疫复合物的形成可在30min内完成:靶蛋白被特异性抗体结合,而μMACS TMProtein A或Protein G微珠结合特异性抗体的Fc段,从而免疫复合物被磁性标记。与葡聚糖或琼脂糖负载材料相比,MACS微珠与蛋白的非特异性结合小到可忽略不计。
     
    另外,传统的免疫沉淀法中耗时,且容易降低回收率的预吸附步骤在此也可省略。接下来,该免疫复合体固定在μ柱上(该μ柱置于μMACS或thermoMACS分离器的磁场中)。MACS柱技术能够通过加入缓冲液对靶蛋白进行温和和严格的洗涤。这种简单的程序在处理危害性材料(如放射性标记的蛋白)时特别有优势。
     
    灵敏的下游分析:最终,免疫纯化的蛋白复合物以很小的体积被洗脱出来,而微珠仍滞留在柱中。用蛋白样品缓冲液洗脱,靶蛋白可直接上样到SDS-PAGE凝胶中进行蛋白染色或Westernblotting1。另外,与免疫沉淀蛋白的酶反应(如激酶实验)也可在μ分选柱中完成。因此,thermoMACS分离器给μ柱提供了37℃和42℃的孵育温度。μMACSProtein A和Protein G微珠不仅改善了标准的免疫沉淀操作,而且显著的促进了相互作用蛋白的研究3,4。这包括将该技术应用于染色质免疫沉淀5或核糖体展示。通过联合使用M柱、MiniMACS或OctoMACS分离器,免疫沉淀能够扩大3-5倍。分选柱μ柱,放大可使用M柱。
     
     
    MACS技术分选IP蛋白


     
        步骤1      步骤2           步骤3            步骤4               步骤5
    1  Lyse cells
    2  dd specific antibody and µMACS Protein A/G MicroBeads
    3  Apply to MACS Column
    4  Remove unbound material by stringent washing
    5  Elute target protein while MicroBeads remain on column
     
     
    优点:
    1  Less than 2 hours 快,不离心
    ——No pre-absorption and overnight incubation necessary
      ——30 min incubation with antibody and MicroBeads - fast reaction
      ——kinetics due to small size of MicroBeads
    2  High purity 纯度好,背景低
    ——high purity through efficient and stringent wash steps
       ——virtually no background as MicroBeads do not bind unspecifically to proteins
    ——Gentle column procedure
    ——convenient, also for radioactive isolations
       ——co-purification of interacting molecules and complexes

     


    A: Androgen Receptor (AR) was immunoprecipitated from DHT-stimulated(lane 1, 3) or unstimulated LNCaP cells (lane 2,  4) with µMACS ProteinG MicroBeads
    (lane 1-2) or with Protein A/G agarose beads (lane 3-4). B:Co-immunopurification of Beta-Catenin (BCat).
    Courtesy of D. Mulholland, Vancouver, Canada
     
     

    130-071-001 µMACS Protein A MicroBeads ¥3,886
    130-071-101 µMACS Protein G MicroBeads ¥3,886
    130-042-601 µMACS Protein A/G Starting Kit ¥13,531
     
     
    130-091-122 μMACS HA Isolation Kit ¥12,380
    130-091-123 μMACS c-myc Isolation Kit ¥12,380
    130-091-124 μMACS His Isolation Kit ¥12,380
    130-091-125 μMACS GFP Isolation Kit ¥14,394
    130-091-493 µMACS Anti-GST Starting Kit ¥20,249

    (来源: 上海优宁维生物科技有限公司


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