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    天津中环线都有哪条路: 通过平板裂解和刮取制备λ噬菌体原种

    上海宝特生命科学发展有限公司2010年11月16日 11:03 点击:1107

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    通过平板裂解和刮取制备λ噬菌体原种

     

    方法:

    1、铺平板感染培养物的制备:

    对直径为10cm的培养皿,取105pfu的噬菌体(通常约为一个噬菌斑重悬液的1/10或一个大噬菌斑重悬液的1/100)与0.1ml铺平板细菌混匀。

    对直径为15cm的培养皿,去2*105pfu的噬菌体与0.2ml铺平板细菌混匀。

    至少要置一个含为感染细胞的对照管,将感染培养物和对照均置于37℃培养20min,将病毒吸附到细胞上。

    如果制备不易生长的λ噬菌体原种、则每0.1ml的铺平板细菌就要接种106pfu的噬菌体。

    2、3ml已熔化的47℃的琼脂糖(10cm平板)或7ml(15cm平板)至感染细胞的第一个试管中,通过轻拍或涡旋振荡数秒混匀,立即倒入已表明的琼脂平板中央。尽量避免气泡的产生。选择平板确保细菌和顶层琼脂糖分布均匀。重复这一步,知道每管中的东西均转移至各个平板中。

    3、将平板于37℃正置约12-16h。

    在培养过程中平板没有倒置,是为了防止顶层琼脂糖滑脱和鼓励在平皿表面形成水珠,后者使得噬菌体更容易扩散。

    在收集时,噬菌斑应相互接触,细菌生长的惟一可见迹象是标志着相邻噬菌斑结合部位的轻薄透明的边缘带。含未感染细胞的屏蔽应形成一光滑的菌苔。

    4、收集:

    ①    当发生融合裂解时,加5mlSM于平板中,然后用无菌的玻璃刮刀轻轻刮取顶层软琼脂糖至一无菌离心管中。

    ②    再加2ML SM于平板中,冲洗剩下的顶层琼脂,与上述离心管的顶层琼脂混合。

    ③    加0.1氯仿至琼脂糖悬浮液中,37℃轻摇混匀15min。

    ④    将悬浮液4000g(5800r/min 于Sorvall  SS-34)4℃离心10min,回收上清,加1滴氯仿。保存病毒原种
     

    (来源: 上海宝特生命科学发展有限公司


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