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    江苏快三大小玩法: Y迷宫训练对成年大鼠海马齿状回细胞的增殖作用

    上海软隆科技发展有限公司2013年5月20日 10:21 点击:1105

    时时彩网络平台 www.qlgr.net  摘要:目的 观察Y迷宫训练对成年大鼠海马齿状回(dentate gyrus ,DG) 神经干细胞前体细胞的增殖作用。

    方法 通过Y迷宫训练,52222脱氧尿嘧啶核苷(52bromo222deoxyuridine ,BrdU) 标记增殖细胞,ABC 免疫细

    胞化学方法观察成年大鼠海马齿状回细胞的增殖情况。结果 Y迷宫训练组海马齿状回BrdU 阳性细胞数明显多

    于对照组< 0. 05) ,Y迷宫训练成绩的优劣与海马齿状回神经细胞增殖的多少存在相关性,学习成绩良好组

    齿状回BrdU 阳性细胞数显著多于学习成绩低劣组< 0. 05) 。结论 Y迷宫训练可促进成年大鼠海马齿状回神

    经干细胞前体细胞的增殖。

    关键词: Y迷宫学习海马细胞增殖

      近年的研究[1 ,2 ]表明:成年哺乳动物海马终生

    存在神经发生(neurogenesis) ,其生发区位于海马齿

    状回的颗粒下层( subgranular layer , SGL) 。成年海

    马神经的发生受多种因素的调节,包括生理因素和

    病理因素。促进神经发生的因素有丰富多彩的环

    境、运动、癫痫等;抑制神经发生的有应激、衰老及5

    羟色胺缺失等[3 ,4 ] 。学习记忆也能促进海马神经

    发生。Gould [5 ]报道经典的条件反射及Morris 

    迷宫学习能促进海马齿状回新生神经元的存活。

    Lemaire [6 ] 的研究表明,Morris 水迷宫学习能促进海马齿状回神经干细胞前体细胞的增殖。目前

    国内外有关学习记忆对海马神经发生的研究大多使

    Morris 水迷宫模型[1 ,5 ,6 ] ,迷宫模型的还未

    见报道。因此,本研究探讨Y迷宫训练对海马神经

    发生的作用。现报道如下。

     材料和方法

    1. 1  材料

    1. 1. 1  实验动物和分组 成年雄性SD 大鼠18

    ,体重180220 g ,苏州大学医学院实验动物中心提供。将动物随机分成对照组(动物置于Y迷宫内

    自由活动,不施以电击和灯光指示,放置的时间和轮

    次同训练组= 6) 迷宫训练组(每日训练3

    ,时间点为900 、1200 、1500 ,每轮训练20 ,

    连续3 d , = 12) 。

    1. 1. 2  实验试剂 BrdU ,美国Roche 公司;BrdU

    单克隆抗体美国Biosource 公司羊抗鼠二抗及

    ABC(avidin2biotin complex ,ABC) 试剂盒,Vector 

    ;DAB 显色剂,美国Sigma 公司。

    1. 2  方法

    1. 2. 1  BrdU 标记 于第一轮和第三轮迷宫训

    练前1 h ,BrdU 50mg/ kg , 溶于生理盐水,腹腔注

    / d ,间隔6 h ,连续3 d。第4 d 处死动物。

    1. 2. 2  学习记忆训练 迷宫由个相同的臂组

    ,分别称为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区。通常把下臂Ⅰ臂)定为起步区,左侧Ⅱ臂为安全区,右侧Ⅲ臂为电

    击区,三臂相交处为隔离区(0 。迷宫底铺以铜

    ,可以通电刺激。三臂顶端各装有15W 的信号

    灯。实验前先将大鼠放入迷宫,让其适应5 min ,

    练组大鼠在起步区予以电击致其逃至安全区,灯光

    持续15 s ,然后熄灯休息45 s ,开始下一次操作。每

    次实验在每只大鼠上重复20 次为一轮。实验在黑

    暗、安静的环境中进行。凡大鼠受电击后10 s 内一

    次性从起步区逃至安全区的反应称为“正确反应”,

    否则为“错误反应”。以连续10 次电击中正确反应

    次或以上定为学会标准。达到学会标准所需的

    电击次数表示学习记忆成绩,电击次数少说明学习

    能力强。

    1. 2. 3  免疫组织化学检测 大鼠经4 %的水合氯

    醛麻醉,开胸,左心室插管至主动脉,先快速灌流

    0. 01mol/ L 的磷酸盐缓冲液( phosphate buffered

    saline , PBS) , 再用4 %的多聚甲醛(paraformalde2

    hyde , PFA) 缓慢灌流。取脑置于4 %PFA 中固

    8 h ,再转入20 %的蔗糖中过夜,从前囟后3. 3

    5. 1 mm 作连续冰冻切片,片厚30 μm ,张取

    张。免疫组织化学ABC 法的步骤详见本实验室

    以往的研究[7 ] ,简要步骤如下:脑片于4 mol/ L 的盐酸中室温下孵育30 min ;0. 1 %的胰酶37 ℃孵育10

    min ;小鼠单克隆抗体BrdU 一抗室温下过夜( 1 

    200 ,Biosource) ;羊抗鼠二抗室温下孵育2 h (A/ B

    200 ,Vector) ;DAB 显色5 min。各步骤间用0. 01

    mol/ L PBS 漂洗,每次5 min。常规封片,

    光镜下观察免疫反应阳性细胞,并计数和作显微摄

    影。

    1. 2. 4  统计方法 每只大鼠随机选取4张脑

    ,光学显微镜下×400 计数每张脑片双侧海

    马齿状回颗粒细胞层(granular cell layer , GCL) 、颗

    粒下层及门区的BrdU 阳性细胞数。取每只大鼠4

    张脑片BrdU 阳性细胞的均数作为统计数据,

    均数±标准差.±s) 表示,并用SPSS10. 0 软件作

    方差分析,Excel 作数据处理并制成统计图。

     结果

    2. 1  学习记忆训练结果 12 只成年大鼠经过3 d

    Y迷宫学习训练后,所有大鼠均达到学会标准。

    2. 2  免疫组化检测结果 对照组成年大鼠海马齿

    状回可见少量的BrdU 阳性细胞,分布在齿状回颗

    粒细胞层、颗粒下层及门区,且大多位于海马齿状回

    颗粒下层。BrdU 阳性细胞常聚集成丛,细胞核较

    ,形态不一,呈圆形、椭圆形或无规则型(1a) ;

    海马齿状回BrdU 阳性细胞数为39. 37 ±2. 32 。训

    练组大鼠海马齿状回的BrdU 阳性细胞亦分布在颗

    粒细胞层、颗粒下层及门区,其中以颗粒下层增多最

    明显(1b、图1c) ;BrdU 阳性细胞数为57. 43 ±

    11. 29 。两组的BrdU 阳性细胞数比较,有显著性差

    < 0. 05) 。

    2. 3  Y迷宫训练成绩优劣与海马齿状回细胞增殖

    的关系 12 只成年大鼠进行Y迷宫训练后,达到学

    会标准时电击次数的均数为40. 75 。学习记忆能力

    优劣的判定,以每只大鼠达到学会标准时的电击次

    数为依据。低于40. 75 ,列为学习成绩良好组=

    6) ;高于40. 75 ,列为学习成绩低劣组= 6) 。免疫

    组织化学结果显示,学习成绩良好组齿状回BrdU

    阳性细胞数(65. 48 ±10. 51) 多于成绩低劣组(49. 38

    ±3. 49) ( P < 005 ,如图2。再将每只大鼠Y迷宫

    训练达到学会标准时的电击次数和齿状回BrdU 

    性细胞数之间作相关分析,发现两者之间呈明显负

    相关= - 0. 91 ,3) 。说明齿状回BrdU 阳性细

    胞数的增加与Y迷宫训练的成绩密切相关,训练成

    绩越好,海马齿状回细胞增殖越多。

     讨论

    海马与学习记忆密切相关。Y迷宫用于检测大

    鼠空间辨别的学习记忆能力,大鼠在迷宫中对电刺

    激出现被动逃避反应,经过多次训练后大鼠能学会

    并记住迷宫安全区的空间位置??占涠ㄎ坏募且湔?/span>

    碍只有在海马或海马周围区域受到损伤的情况下才

    会出现。摘除双侧海马出现空间学习、记忆障碍,1. 2. 4  统计方法 每只大鼠随机选取4张脑

    ,光学显微镜下×400 计数每张脑片双侧海

    马齿状回颗粒细胞层(granular cell layer , GCL) 、颗

    粒下层及门区的BrdU 阳性细胞数。取每只大鼠4

    张脑片BrdU 阳性细胞的均数作为统计数据,

    均数±标准差.±s) 表示,并用SPSS10. 0 软件作

    方差分析,Excel 作数据处理并制成统计图。

     结果

    2. 1  学习记忆训练结果 12 只成年大鼠经过3 d

    Y迷宫学习训练后,所有大鼠均达到学会标准。

    2. 2  免疫组化检测结果 对照组成年大鼠海马齿

    状回可见少量的BrdU 阳性细胞,分布在齿状回颗

    粒细胞层、颗粒下层及门区,且大多位于海马齿状回

    颗粒下层。BrdU 阳性细胞常聚集成丛,细胞核较

    ,形态不一,呈圆形、椭圆形或无规则型(1a) ;

    海马齿状回BrdU 阳性细胞数为39. 37 ±2. 32 。训

    练组大鼠海马齿状回的BrdU 阳性细胞亦分布在颗

    粒细胞层、颗粒下层及门区,其中以颗粒下层增多最

    明显(1b、图1c) ;BrdU 阳性细胞数为57. 43 ±

    11. 29 。两组的BrdU 阳性细胞数比较,有显著性差

    < 0. 05) 。

    2. 3  Y迷宫训练成绩优劣与海马齿状回细胞增殖

    的关系 12 只成年大鼠进行Y迷宫训练后,达到学

    会标准时电击次数的均数为40. 75 。学习记忆能力

    优劣的判定,以每只大鼠达到学会标准时的电击次

    数为依据。低于40. 75 ,列为学习成绩良好组=

    6) ;高于40. 75 ,列为学习成绩低劣组= 6) 。免疫

    组织化学结果显示,学习成绩良好组齿状回BrdU

    阳性细胞数(65. 48 ±10. 51) 多于成绩低劣组(49. 38

    ±3. 49) ( P < 005 ,如图2。再将每只大鼠Y迷宫

    训练达到学会标准时的电击次数和齿状回BrdU 

    性细胞数之间作相关分析,发现两者之间呈明显负

    相关= - 0. 91 ,3) 。说明齿状回BrdU 阳性细

    胞数的增加与Y迷宫训练的成绩密切相关,训练成

    绩越好,海马齿状回细胞增殖越多。

     讨论

    海马与学习记忆密切相关。Y迷宫用于检测大

    鼠空间辨别的学习记忆能力,大鼠在迷宫中对电刺

    激出现被动逃避反应,经过多次训练后大鼠能学会

    并记住迷宫安全区的空间位置??占涠ㄎ坏募且湔?/span>

    碍只有在海马或海马周围区域受到损伤的情况下才

    会出现。摘除双侧海马出现空间学习、记忆障碍,可见Y迷宫学习训练需要海马的参与,是依赖海马的

    学习训练[8 ] 。

      实验中,我们用52222脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)

    标记增殖细胞。BrdU 是胸腺嘧啶核苷的类似物,

    细胞处于DNA 合成期() ,掺入到新合成的

    DNA ,能较好地反映齿状回细胞的增殖情况。

    本实验结果发现,未经Y迷宫训练的大鼠海马

    齿状回内可见少量的BrdU 阳性细胞,且大多沿颗

    粒下层聚集状分布,提示增殖细胞是由一个神经干

    细胞前体细胞分裂而来的。学习训练可以影响海

    马的神经发生,Morris 水迷宫学习可促进海马齿状

    回神经前体细胞增殖及存活[5 ,6 ] 。本实验结果显

    ,Y迷宫训练组齿状回BrdU 阳性细胞数多于对

    照组,其中以颗粒下层增多最明显??杉?/span>Y迷宫训

    练能增加齿状回BrdU 阳性细胞数,促进海马神经

    干细胞前体细胞的增殖。

    海马新生神经元参与了依赖海马的学习记忆形

    成。跑步、丰富多彩的环境[3 ,4 ]能促进海马神经发生,提高水迷宫实验的成绩;长期应激[3 ,4 ]在抑制海

    马神经发生的同时,降低水迷宫实验成绩。这些都

    支持海马神经发生与空间学习能力相关的论点。本

    实验结果表明:学习成绩的优劣与海马齿状回神经

    发生存在相关性,学习成绩良好组齿状回BrdU 

    性细胞多于成绩低劣组。Ambrogini [9 ]也报道过

    类似的结果,他们发现Morris 水迷宫学习成绩与海

    马齿状回神经发生直接相关,成绩良好的大鼠齿状

    BrdU 阳性细胞多于成绩低劣的大鼠。

    至于这些新生细胞的分化前景,有待今后进一

    步探讨。

    (来源: 上海软隆科技发展有限公司


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