• 中国资本市场开放出大招 跨境证券投资更便利 2019-10-13
  • 世卫将“游戏障碍”列为新疾病 哪些症状可被确诊? 2019-10-13
  • 景区去门票化积弊短期难除 如何摆脱门票依赖? 2019-10-08
  • 东风路老旧小区欲华丽变身 微改造项目勘察设计已招标 ——凤凰网房产广州 2019-10-08
  • 翔龙无人机服役后首次曝光,大幅提升空军情报收集能力 2019-09-19
  • 证监会去年对外公开监管信息14560条 2019-09-19
  • 人民网欧洲中心分社记者报道集 2019-09-06
  • 图解:短视频平台频遭约谈敲响警钟,野蛮生长要不得! 2019-09-06
  • 中考期间广州部分公交线路有调整 2019-09-01
  • 减肥必备!这十种食物饱口福还能吃出好身材 2019-09-01
  • “蛟龙” 吸引世界目光(砥砺奋进的五年·重大工程巡礼) 2019-08-19
  • 李克强:扩大跨省异地就医直接结算范围 2019-08-11
  • 次仁卓玛一家的端午节 2019-08-11
  • 市人大常委会召开党组会议传达学习全国两会精神张轩主持并讲话 2019-08-09
  • 世界杯期间在家撸串的正确姿势-热门标签-华商网数码 2019-08-06
  • 来宝网Logo

    热门词:生物显微镜 水质分析仪 微波消解 荧光定量PCR 电化学工作站 生物安全柜

    现在位置时时彩网络平台>技术资料首页>实验技术>生物技术>如何绘制表达谱并验证?

    时时彩官方开奖: 如何绘制表达谱并验证?

    生物通2010年2月23日 12:33 点击:1460

    时时彩网络平台 www.qlgr.net 尽管第一个microRNA是在1993年发现的,但直到最近几年,人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。miRNA通过与转录本的相互作用,关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达,这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时,miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。

    然而,miRNA很小,这就增添了研究的难度。如何绘制灵敏而特异的表达谱?如何上调或下调特定的miRNA?如何验证结果?全靠自己摸索,体会是很深,但时间也花不少。生物通收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验,这将让你少走弯路。

     

     

    Q1:你使用什么方法来确保灵敏而特异的miRNA表达谱?为什么?

    Galina Gabriely(哈佛大学)

    我们通常利用多重定量PCR来对少量的人miRNA进行小规模图谱分析。这种方法的灵敏度和特异性比芯片更好,因此在待分析miRNA数量不多时是首选。多重定量PCR图谱分析的准确性可用更加灵敏的单重分析来验证。

    Peng Jin(埃默里大学)

    我们一般采用miRNA TaqMan分析来确定特定miRNA的表达。我们尝试了多种方法,发现TaqMan的灵敏度和特异性更好。当然,在小RNA的数字表达谱上,我们也使用高通量测序,它与TaqMan分析有着很好的相关性。

    Winston Kuo(哈佛大学)

    我们已经使用过多种miRNA图谱分析技术,包括Exiqon、Febit、High Throughput Genomics、Invitrogen和Luminex。Exiqon的microRNA芯片平台含有LNA寡核苷酸捕获探针。LNA是核苷衍生物,它提高了双链分子的解链温度。这大大改善了双链分子的热稳定性和特异性。LNA核苷的掺入还能实现捕获探针的Tm均一化。这对芯片的性能非常重要,因为miRNA很短,Tm差异大。Luminex的FlexmiR microRNA panel结合了Exiqon的LNA探针来实现高特异性。HTG则采用了互补的核酸酶?;ぬ秸胗胙分械膍iRNA杂交,然后进行S1核酸酶反应来破坏错配的探针,非常灵敏。

    Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

    在我们实验室,我们正在采用定制的芯片,主要因为它经济且易用。对于更高的灵敏度,也有好的选择,如Exiqon和Agilent的芯片及Applied Biosystems的TaqMan array。

    Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)

    在多年的northern杂交和点杂交后,我们越来越多地使用Applied Biosystems的miRNA TaqMan分析,它非常特异和灵敏,而且数据总是与northern blot很好地关联。

    Q2:你如何验证表达结果?

    Galina Gabriely(哈佛大学)

    我们使用TaqMan microRNA assay的定量RT-PCR,并用其它稳定表达的miRNA来标准化数据。你也可以使用snoRNA来标准化。不管怎样,我们一般使用两个或三个不同分子来标准化,以确??煽康卦ぜ苖iRNA的量。同时,为了确保结果可重复,我们会重复实验。

    Peng Jin(埃默里大学)

    通过早期不同分析形式的比较,我们发现miRNA TaqMan分析是非??煽康?。对于高丰度的miRNA,我们也用传统的northern blot来验证表达数据。

    Winston Kuo(哈佛大学)

    我们利用三种互补的策略验证表达结果:
    1. qPCR:我们使用过两种方法,miScript SYBR Green System(Qiagen)和TaqMan miRNA assays(ABI)。我们倾向于前者,因为它含有poly-A加尾方法,回避了内源3’端miRNA序列多样性的问题。这种多样性是TaqMan茎环结构反转录引物策略的问题。从技术的角度,单个oligo dT的反转录反应(Qiagen)在费用、移液操作和可变性方面优于茎环结构的反转录。我们在384孔板上开展qPCR分析,每个处理组有四个样品和三次实验重复(总共12个孔),以获得可靠、重复性好的结果。同时还包括无模板、无引物的对照。

    2. Northern blotting:我们使用放射性标记的LNA寡核苷酸作为探针,进行miRNA的northern blot。许多miRNA在功能相关家族中发现,这些家族成员的种子序列为100%同源,只有3’端变化。因此,在使用qPCR或northern时,你必须验证分析只检测目的miRNA,而不是其它成员。我们在玉米(Zea)RNA载体背景中加入合成的成熟miRNA(IDT)来验证。

    就northern来说,每个miRNA家族成员的合成miRNA在含有8M尿素的15% PAGE胶上进行。优化杂交温度,让LNA探针只与目的miRNA结合,而不与其它成员结合。一旦利用加标策略建立了适当的northern杂交条件,就能应用于实验样品。

    3. 原位杂交:我们也利用Exiqon的DIG标记的miRCURY LNA microRNA检测探针,来确认我们的miRNA表达结果和组织特异性。

    Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)

    无论使用哪个平台,小心验证所有的芯片结果是很重要的。我们一般使用northern blotting(当我们有较多RNA时),或者实时定量PCR(当RNA比较珍贵时)。我们发现只有操作正确,两种方法都能产生高质量的表达数据。Northern blotting比较便宜,但需要很多RNA,而定量PCR更灵敏,也更贵。

    (来源: 生物通 )


    全年征稿 / 资讯合作

    联系邮箱:[email protected]

    版权与免责声明

    • 凡本网注明“来源:来宝网”的所有作品,版权均属于来宝网,转载请必须注明来宝网, 时时彩网络平台,违反者本网将追究相关法律责任。
    • 本网转载并注明自其它来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
    • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。
  • 中国资本市场开放出大招 跨境证券投资更便利 2019-10-13
  • 世卫将“游戏障碍”列为新疾病 哪些症状可被确诊? 2019-10-13
  • 景区去门票化积弊短期难除 如何摆脱门票依赖? 2019-10-08
  • 东风路老旧小区欲华丽变身 微改造项目勘察设计已招标 ——凤凰网房产广州 2019-10-08
  • 翔龙无人机服役后首次曝光,大幅提升空军情报收集能力 2019-09-19
  • 证监会去年对外公开监管信息14560条 2019-09-19
  • 人民网欧洲中心分社记者报道集 2019-09-06
  • 图解:短视频平台频遭约谈敲响警钟,野蛮生长要不得! 2019-09-06
  • 中考期间广州部分公交线路有调整 2019-09-01
  • 减肥必备!这十种食物饱口福还能吃出好身材 2019-09-01
  • “蛟龙” 吸引世界目光(砥砺奋进的五年·重大工程巡礼) 2019-08-19
  • 李克强:扩大跨省异地就医直接结算范围 2019-08-11
  • 次仁卓玛一家的端午节 2019-08-11
  • 市人大常委会召开党组会议传达学习全国两会精神张轩主持并讲话 2019-08-09
  • 世界杯期间在家撸串的正确姿势-热门标签-华商网数码 2019-08-06
  • 雷速比分网 3d选号软件下载 注册送38元网站 新网球王子世界排名 竞彩足球专家推荐预测 金马国际娱乐开奖直播 推牌九技巧分解教学 腾讯欢乐麻将全集下载安装 AB娱乐 南方双彩网走势图首页 河北11选5计算机 体彩浙江6+1第18122期 足球指数网 东星国际娱乐平台 陕西11选5选号技巧